Hace unos programas, rendía homenaje a algunas de las figuras que más significativamente habían contribuido al descubrimiento de que el ADN es la molécula portadora de la información genética. Hoy finalizo esta serie con un homenaje a Matthew Meselson y Franklin Stahl, quienes descubrieron el modo como el ADN se replica.

En su publicación de la estructura del ADN, en 1953, Watson y Crick indicaron que esta inmediatamente sugería un mecanismo por el que la información podía ser copiada y la copia ser transmitida así a las siguientes generaciones. Sin embargo, Watson y Crick no fueron más específicos y en su artículo no describieron lo que tenían en la cabeza acerca del mecanismo de replicación. Recordemos que la información almacenada en el ADN sigue unas reglas, la más importante de las cuales es que una A de una hebra se une a una T de la otra y una C de una hebra se une a una G de la otra. Se dice que A y T, adenina y timina, son bases complementarias, como también lo son la C y la G, la citosina y la guanina. Por esta razón, cada hebra contiene información que puede ser usada para fabricar otra hebra complementaria, lo que conduciría a la duplicación de la molécula completa.

Sin embargo, no estaba nada claro cómo la información era copiada de hebra en hebra. En los años 50 del pasado siglo, en aquellos años del amanecer de la biología molecular, en ausencia de conocimiento alguno sobre la replicación del ADN, todas las posibilidades debían ser consideradas para alcanzar la verdad. Y había varias posibilidades.

La primera era la existencia de un mecanismo que implicaría la separación de las dos hebras del ADN y la utilización de la información complementaria en cada una de ellas para fabricar otras dos hebras idénticas. Se trataba de un mecanismo semiconservativo. Cada una de las dos moléculas de ADN resultantes conservaría una hebra de la molécula original, pero la otra hebra sería nueva. De este modo se conservaba la mitad de la molécula original en cada molécula duplicada.

Otra posibilidad era que una vez separadas las dos hebras originales y utilizada la información para generar hebras nuevas, estas dos hebras nuevas se unían entre sí, y las dos hebras originales también se unían entre sí. En este caso, se generaría enteramente una nueva molécula de ADN y se mantendría la original. Esta idea recibió el nombre de hipótesis conservativa, ya que la molécula de ADN original se conservaba. Esta hipótesis era atractiva desde el punto de vista de que la información original se guardaría protegida de posibles errores de copia, de las siempre temidas mutaciones.

Finalmente, aún se propuso otra idea, que se denominó la hipótesis dispersiva. En ella, la molécula de ADN original se cortaba en secciones que se utilizaban para generar nuevas secciones de ADN. Las secciones generadas, las viejas y las nuevas, eran después ensambladas y las moléculas resultantes contendrían una mezcla de fragmentos viejos y nuevos a lo largo de su longitud. Creo que esta idea es la más extraña de las tres, pero cosas más increíbles que estas se ven todos los días en el maravilloso funcionamiento de la vida.

Para dirimir entre estas tres posibilidades, era necesario diseñar y realizar un experimento. Por muy sensata y bella que parezca una idea, esta no vale nada sin evidencia que la respalde. Si esta máxima fuera seguida por la mayoría de los seres humanos, el mundo cambiaría de modo radical.

Era pues necesario recabar evidencia que apoyara alguna de las tres posibilidades e idealmente, también descartara a las otras. Aquí es cuando surge la genialidad de dos científicos estadounidenses, Matthew Meselson y Franklin Stahl. Estos investigadores fueron capaces de combinar varios avances realizados en biología, física, química y técnicas analíticas, y diseñar un ingenioso experimento que hace historia y que permitió concluir que la replicación del ADN sigue un proceso semiconservativo. Veamos cómo lo hicieron.

Meselson y Stahl se dijeron que, para dirimir entre las posibilidades mencionadas, era necesario poder distinguir las hebras o fragmentos de ADN originales de los nuevamente producidos. Para ello, utilizaron el marcaje completo del ADN con el isótopo 15 del nitrógeno. Este es uno de los avances en física y química sobre los que Meselson y Stahl se apoyaron para su experimento. Igualmente, se inspiraron en el experimento de Hershey y Chase (del que hablé hace dos programas) a los que citan en su publicación, y que, como sabéis, también utilizaron la técnica de marcaje isotópico para confirmar que el ADN es la molécula portadora de la información genética.

El 15N es un isótopo estable, es decir, no radiactivo, del nitrógeno, elemento químico que cuenta solo con otro isótopo estable más, el 14N, el más frecuente, ya que el 15N supone solo alrededor del 0,37% de todo el nitrógeno. Recordemos que los isótopos son todos átomos del mismo elemento químico, por lo que tienen el mismo número de protones en el núcleo, pero distinto número de neutrones. El 15N posee un neutrón más en su núcleo que el 14N, y es, por ello, un poco más pesado que este. Las moléculas que incorporen en su composición 15N serán también más pesadas, más densas, que las que solo incorporen 14N.

Para producir ADN que solo contuviera 15N, los dos investigadores pusieron a crecer a la bacteria Escherichia coli, una bacteria normalmente inofensiva de la flora intestinal muy utilizada desde esos años en los laboratorios de biología molecular, en un medio de cultivo que contenía cloruro de amonio con 15N como única fuente de nitrógeno. De este modo, todas las moléculas producidas por la bacteria que necesitaran nitrógeno en su composición incorporarían 15N, en lugar de 14N, entre ellas, el ADN.

Fabricar cloruro de amonio con 15N no es tarea fácil, y mucho menos lo era en los años 50 del pasado siglo. Hoy, se puede aumentar la proporción de 15N por varias técnicas, como son la difusión diferencial de gases (el 14N2 gas difunde más rápido que el 15N2) y la centrifugación de derivados químicos de nitrógeno, (los derivados de 15N, más pesados, son centrifugados hacia zonas más densas del fluido en el que se centrifuga). Recordemos que la centrifugación consiste simplemente en introducir a las muestras bajo estudio en un tubo y hacerlas rotar a altas velocidades, aumentado así mucho la fuerza centrífuga, la cual puede alcanzar miles de veces la fuerza de la gravedad. De este modo, se aumenta la velocidad a la que los distintos componentes de la muestra sedimentan en el fondo del tubo, o se estabilizan en la zona del tubo de centrifugación que corresponde a su densidad.

Además de esas técnicas, también se puede generar 15N en aceleradores de partículas, por ejemplo, utilizando 14N y bombardeándolo con deuterio, un isótopo pesado del hidrógeno. Esto genera 15O, que es radiactivo y que rápidamente se desintegra y se convierte en 15N.

Desafortunadamente, Meselson y Stahl no mencionan en su artículo el método utilizado para generar cloruro de amonio con 15N en una pureza del 96,5%, que es el cloruro de amonio que utilizan en su medio de crecimiento para la E. coli. Sí indican, en cambio, que las bacterias fueron crecidas en este medio durante catorce generaciones, lo que prácticamente asegura que todo el nitrógeno de su ADN es 15N en la misma proporción que la del cloruro de amonio del medio de crecimiento, es decir, recordemos, el 96,5%.

Estas bacterias con ADN más pesado, más denso, de lo normal gracias al 15N, fueron transferidas de manera abrupta a un medio con solo 14N. Al replicarse en este medio, las bacterias generarían nuevas cadenas de ADN que, a partir de ese momento, solo incorporarían 14N en su composición.

Ahora tocaba analizar la densidad de ese ADN. Para hacerlo, Meselson y Stalh utilizaron una técnica que ellos mismos habían desarrollado unos años antes junto con el científico Jerome Vinograd, desaparecido en 1976. Se trataba de la llamada ultra centrifugación en gradiente de densidad. Básicamente, lo que hicieron fue centrifugar a elevada velocidad de rotación ADN aislado de las bacterias en una solución de cloruro de cesio. El cesio es un elemento de la familia del sodio, que como sabemos también se combina con el cloro para dar lugar a la sal común, pero el cesio es mucho más pesado que el sodio. Las soluciones de CsCl son, por ello, más densas que las de NaCl. Además, al someterlas a centrifugación a alta velocidad se establece un gradiente de densidad, con una menor densidad cerca del centro de la rotación, en la superficie del tubo, y una mayor densidad más lejos del eje de rotación, es decir, en el fondo del tubo. Las moléculas con menor densidad que la del gradiente, flotan, las de mayor densidad, sedimentan en el fondo del tubo, y las de densidad comprendida en el rango del gradiente quedan concentradas en la zona de densidad que les corresponde.

Meselson y Stahl afinaron esta técnica de modo que se generara un gradiente de densidad que permitiera separar el ADN con 14N del ADN con 15N, ya que ambas moléculas tienen densidades diferentes. El ADN con 14N flotaría un poco más que el ADN con 15N, y se situaría algo más cerca de la superficie del tubo, separándose del ADN con 15N, que se situaría más cerca del fondo.

¿Qué fue lo que encontraron?

En primer lugar, confirmaron que el ADN con 15N se separaba con claridad del ADN con 14N en su sistema de centrifugación en gradiente de densidad. A pesar de que los cálculos indicaban que el ADN con 15N sería solo un 1% más denso, Meselson and Stahl pudieron ajustar la concentración de la solución de CsCl de manera que el gradiente de densidad generado al centrifugar fuera lo suficientemente fino como para separar perfectamente ambos tipos de ADN gracias a su diferencia de densidad. La posición del ADN en el tubo tras la centrifugación podía detectarse iluminando con radiación ultravioleta, ya que el ADN no deja pasar la luz ultravioleta de una determinada longitud de onda, lo que aún hoy se usa en todos los laboratorios del mundo para determinar la cantidad, concentración y pureza de diversas preparaciones de ADN.

Tras la primera ronda de división bacteriana crecida con 14N, solo aparecía ADN cuya posición en el tubo de centrifugación correspondía a una densidad intermedia entre la del ADN con 14N y la del ADN con 15N. Este resultado descartaba la replicación conservativa, (que hubiera proporcionado ADN de dos densidades y, por tanto, en dos posiciones diferentes), pero era compatible con ambas ideas restantes, la de la replicación semiconservativa y la de la replicación dispersiva.

Sin embargo, tras una segunda ronda de división bacteriana, se observó ADN en dos posiciones diferentes del gradiente de densidad tras la centrifugación. La primera correspondía a ADN de densidad intermedia entre el ADN con 14N y el ADN con 15N, y la segunda correspondía a ADN con 14N. El ADN solo con 15N había desaparecido. Este resultado descartó la idea de la replicación dispersiva, ya que, de haber sido cierta, se hubiera observado ADN en una sola posición, correspondiente a una densidad aún menor que la densidad intermedia, pero en todo caso únicamente presente en una sola posición del gradiente de densidad generado en el tubo de centrifugación.

La presencia de ADN en dos posiciones diferentes en el tubo de centrifugación, correspondientes a dos densidades también distintas, tras dos rondas de división bacteriana, era claramente indicativa de que la hipótesis semiconservativa era la correcta y la dispersiva, falsa. La conclusión era que una de las hebras del ADN sirve como molde para copiar una nueva hebra. Esta es la propiedad que hace la técnica de PCR posible y con ella una enorme diversidad de aplicaciones, entre las que se encuentran las pruebas diagnósticas de la COVID-19, que estoy seguro os han realizados a muchos y muchas de vosotras, por narices.

Además de esta proeza técnica y científica, Meselson y Stahl realizaron numerosas otras aportaciones en el campo de la biología molecular durante sus largas carreras. Ambos están todavía vivos. Meselson cuenta con 93 años y Stahl, con 94. Ha debido ser un orgullo para ellos ver su experimento descrito en numerosos libros de texto de Bioquímica y Biología Molecular, de Biología Celular, de Genética, etc. Yo ya estudié su experimento —con menos detalle que lo explicado aquí hoy, debo decir— durante mis estudios universitarios, hace ya demasiado tiempo. No obstante, a pesar de esta importante contribución científica, estos investigadores no han sido galardonados con el Premio Nobel. No sé si esto es o no justo, pero, en todo caso, es mi intención con este podcast rendirles un pequeño homenaje ahora que están todavía vivos y poder decirles, aunque no creo que lo llegue a escuchar, que gracias a su trabajo, la vida de muchas personas ha sido un poco mejor.

Con Meselson y Stahl termino esta serie de programas-homenaje a las personas que contribuyeron a descubrir la estructura del ADN, y cómo la información genética que contiene es transmitida de generación en generación. Es un homenaje que me he tomado en serio las dos últimas décadas y con el que llegué a conseguir que Albacete, ciudad de España donde resido, tenga una avenida dedicada a la científica que más contribuyó a estos descubrimientos: Rosalind Franklin.

Y con esto, me despido. Espero que este programa te haya ayudado a comprender mejor las dificultades que conlleva realizar un buen experimento que consiga aumentar nuestra compresión sobre la Naturaleza y, al mismo tiempo, hayas podido apreciar la belleza de uno de los más interesantes de la historia de la biología.

(Jorge Laborda, agosto 2023)

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